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細(xì)胞請(qǐng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大部分細(xì)胞是37℃，5% CO2，濕度100%環(huán)境下培養(yǎng)的。有極少部分細(xì)胞培養(yǎng)條件不*，請(qǐng)仔細(xì)閱讀相應(yīng)的細(xì)胞說明書，使用正確的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；
細(xì)胞于培養(yǎng)瓶或皿中培養(yǎng)，加入適量說明書上標(biāo)注的細(xì)胞相應(yīng)*培養(yǎng)基（一般液面高度2-3mm即可）。

<2>細(xì)胞傳代（以下步驟適用于10cm皿）

細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)80%以上時(shí)即可傳代，先將細(xì)胞培養(yǎng)基取出3mL用15mL離心管裝好，其他培養(yǎng)基全部吸干舍棄；
培養(yǎng)皿加入2-3mL無菌PBS，輕輕晃動(dòng)皿，使PBS浸洗到皿底所有部位，PBS吸干舍棄；
加入1mL胰酶，輕輕晃動(dòng)皿，使胰酶浸沒到皿底所有部位，將皿蓋好放入培養(yǎng)箱中消化；

3min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞不再貼壁，即可加入*步收集的培養(yǎng)基混勻；

若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至不貼壁為止；
將細(xì)胞懸液均勻分成幾份，分別加入不同培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加新培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

<3>相關(guān)問題

部分細(xì)胞在傳代后時(shí)，會(huì)有以下現(xiàn)象：細(xì)胞內(nèi)會(huì)有黑色小點(diǎn)、細(xì)胞間隙有些顆粒物、培養(yǎng)基漂浮一些死細(xì)胞或者細(xì)胞長(zhǎng)的極慢。出現(xiàn)以上現(xiàn)象時(shí)，可以咨詢本公司技術(shù)人員此現(xiàn)象是否正常及相關(guān)處理方式，不要頻繁換液，大多數(shù)細(xì)胞1周換液2-3次即可。
細(xì)胞碎片較多、背景較臟時(shí)，貼壁細(xì)胞用PBS漂洗兩次、懸浮細(xì)胞打散后低速離心（900rpm，3min）能有效改善。
傳代比例建議1:2-1:3，長(zhǎng)得比較快的細(xì)胞可以1：3，比較慢的按1:2傳代。傳代后，建議不要使用傳代前培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基，會(huì)有大量細(xì)胞碎片甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡的風(fēng)險(xiǎn)。
細(xì)胞狀態(tài)不好或者生長(zhǎng)極慢的時(shí)候，可以通過增加血清濃度調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)及生長(zhǎng)速度。
請(qǐng)不要隨意更換培養(yǎng)基，因?qū)嶒?yàn)需要，可以逐步馴化。

懸浮傳代：混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗一次。

細(xì)胞凍存

<1>凍存操作

凍存液配方：建議使用92%FBS+8%DMSO，客戶自身實(shí)驗(yàn)室所使用的凍存液也可以適用，血清濃度不低于30%，DMSO含量不高于12%即可。
收集細(xì)胞按照以上細(xì)胞傳代步驟操作至第④步后，將細(xì)胞懸液收集入15mL離心管，離心（1200rpm，3min）；
棄上清，加入配制好的凍存液，重懸細(xì)胞，懸液加入無菌凍存管中；
將凍存管在4℃靜置10min，后將之正置于室溫下的厚壁有蓋泡沫盒中，蓋緊盒蓋，放入-80℃冰箱過夜，第二天放入液氮即可長(zhǎng)期保存。

<2>相關(guān)問題

10cm皿的細(xì)胞長(zhǎng)滿一般可以凍存2-3管，部分細(xì)胞長(zhǎng)的比較慢，凍存的細(xì)胞密度要稍微大點(diǎn)，以防止復(fù)蘇后生長(zhǎng)困難。
凍存液中含的DMSO請(qǐng)使用細(xì)胞級(jí)DMSO，同時(shí)濃度不要太高。部分細(xì)胞在10%DMSO條件下凍存會(huì)死亡，所以DMSO濃度5%-8%是比較推薦的濃度。
細(xì)胞凍存及復(fù)蘇遵循慢凍快融的原則，即凍存時(shí)溫度不能急劇下降，應(yīng)控制溫度緩慢下降。復(fù)蘇時(shí)應(yīng)快速融化，融化后盡快加入培養(yǎng)基中。
凍存時(shí)建議設(shè)置凍存檢測(cè)，即取0.2-0.3mL的凍存液重懸的細(xì)胞于一個(gè)凍存管中，與正常體積凍存的細(xì)胞共同凍存，至液氮后復(fù)蘇檢查凍存結(jié)果。凍檢合格前，留一部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，以防萬(wàn)一。

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